论文浅述动物源性肺炎克雷伯菌常见分型方法，本文是动物类有关学士学位论文范文与雷伯和肺炎和浅述相关论文参考文献范文.
摘 要：分型技术分析研究常用于确定菌株间的流行病学相关性,对细菌病的预防、监测起到积极的作用.本研究主要对肺炎克雷伯菌从传统分型方法和现代分子分型进行阐述,为动物源性肺炎克雷伯菌分型研究提供依据.
关键词：肺炎克雷伯菌；传统分型；多位点序列分型
中图分类号：S852.6 文献标识码：A 文章编号：1008-6137（2018）01-0013-04
0 引言
肺炎克雷伯菌属于肠杆菌科克雷伯菌属,革兰阴性.广泛存在于自然环境中,健康人和动物的呼吸道、消化道及泌尿生殖道也分离到过该菌.
人医研究报道表明,肺炎克雷伯菌已经成为医院内获得性肺炎（HAP）的常见致病菌.在兽医研究领域,各种家禽、家畜、特种经济动物及多种野生动物均被报道过感染肺炎克雷伯氏菌.近年来由于抗生素的广泛使用,导致动物源性肺炎克雷伯菌已经产生了多种耐药菌株,这给临床预防、诊断及治疗都带来了许多困难.通过分型技术分析研究确定菌株间的流行病学相关性,对肺炎克雷伯菌病的预防、监测起到积极的作用[1].传统分型方法包括血清分型、药物敏感性分型、噬菌体分型及克雷伯素分型.随着分子生物学的高速发展,肺炎克雷伯菌的分型已进入分子分型时代,现代分子分型技术主要包括脉冲场凝胶电泳（PFGE）、质粒DNA图谱分析及多位点系列分析（MLST）等技术.笔者通过翻阅资料,就目前肺炎克雷伯菌的分型研究进行浅述,旨在对肺炎克雷伯菌进行深入研究提供依据.
1 传统分型方法
1.1 生物分型
根据肺炎克雷伯菌的生化反应特征建立的生物分型系统,据此对不同来源的菌株进行生物学分型研究,但此方法需要的反应步骤较多,并且有些反应培养时间很长,故生物分型不是最好的研究工具.
1.2 血清学分析
血清学分型是目前应用最广泛的分型方法,这种方法主要是依据其荚膜抗原的不同来分类,肺炎克雷伯菌主要包括K、O两种抗原,利用K抗原来进行分类的应用还是比较普遍.利用这一特性已成功将肺炎克雷伯菌分为82个血清型,此种方法重复性较好,可以用于鉴别临床大多数的分离株；不足之处在于有时候会出现血清学交叉反应,结果判断易受影响,而且分型地过程费时费力.
1.3 噬菌体分型
上世纪60年代,利用噬菌体对病原菌进行分型的方法被研究学者提出.噬菌体是引起细菌、真菌、放线菌及螺旋体等一类微生物感染的病毒的总称,因可引起部分宿主菌的裂解,所以被称为噬菌体.噬菌体分型方法具有结果易判读,重复性好等特点,但分型率较低[2].
2 现代分型技术
2.1 脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型
普通的凝胶电泳中,DNA大分子（10kb以上）移动的速率相互接近,因此很难形成足以区分的条带.PFGE 技术于1984 年首次被Schwartz 和Calltor报道,PFGE技术是在凝胶周围外加一个正交交变电场,使DNA分子能够按照分子量大小区分开.普通单向电场下的琼脂糖凝胶电泳,只能分离500kb以下的DN段,而较大的DNA分子易陷入凝胶孔中,呈停滞状态.为解决这一难题,Schwartz等人提出了脉冲电场凝胶电泳的设计思路[3],PFGE技术是在凝胶周围至少提供两个方向的电场,并且是在设定时间内周期变换.电泳前,先用蛋白溶解酶进行水解,再经稀有位点的DNA限制酶消化,这一过程会使染色体被切割成5～10个大小约10～800kb的片段,在交变电场中,大分子量片段会不断改变迁移方向,从而绕过狭小的凝胶孔隙得以分离.利用PFGE技术可以将细菌整个基因组限制性内切酶的反应片段清楚的显示在一块凝胶上,且重复性很好,特异性和分辨力高.利用PFGE技术所得到的全基因染色体组型,被称为电泳核型.PFGE试验结果可通过视野阅读,比较酶切图谱的条带.因为PFGE能够检测出染色体上所有的酶切位点的变化,因此可以很好的反映出全部基因之间的相关性,且重复性很好,为分型提供可靠的依据,因此也广泛应用于多种细菌的分型研究.Tenover等认为,分离株与爆发菌株间有0～3条不同条带,一般认为分离株来自于爆发,有4～6条不同条带,则认为分离株可能来自于爆发,如果两者之间有7条或7条以上不同条带,那么认为分离株与爆发流行株不存在流行病学关系.
国外学者C.Branger 利用PFGE 法对1992～1994年间收集的70株产ESBL肺炎克雷伯菌进行分型研究,得到了6个主要型别,其中1型占到了84％,同时与1988年及1991年的爆发流行的流行株比较,发现与以往的流行株电泳图谱存在相关性.Hafid Chetoui在1999年也曾利用PFGE技术对造成医院感染的39株肺炎克雷伯菌进行相关性分析,同时结合抗生素敏感性分型结果,研究菌株的耐药表型和基因型的关系,为疾病的监测与治疗提供依据.国内,胡冬梅等人运用PFGE技术分析18株临床分离的肺炎克雷伯菌,通过分析PFGE带型资料,计算菌株之间的相关性系数,最后将肺炎克雷伯菌分为3个群,大体上表现为敏感菌为一个群,耐药菌为一个群.朱佩琼[4]等利用PFGE技术对从浙江大学附属第一医院分离的49 株分离菌进行分型,最后分为6 个型,每个型又包含不同的亚型.此外,周清德[5]等人也利用该技术对北京地区医院内104株肺炎克雷伯菌进行了研究.据报道,对肺炎克雷伯菌来说,目前最为准确的分型方法就是PFGE技术,它的分辨力及准确性相对来说都较高.但此种方法操作复杂,耗时长,而且试剂、测序等费用昂贵.另外,电泳条件的稍微改变,就会影响试验结果,这对不同实验室的结果相互比较带来困扰.
2.2 多位点序列分型（Multilocus sequence typing,MLST）
多位点序列分型技术是近十多年才发展起来的分析方法,具有较高的分辨力,而且应用的范围也比较广,既可用于对流行病学的研究,也适用于分子进化及种群结构的研究,同时,MLST在种群的进化及全球爆发疾病的监测方面也具几个碱基序列作为引物结合位点,进行扩增.不同个体由于基因组的序列不同,酶切时就出现差异,经扩增后,经凝胶电泳就可显现出来.目前,AFLP技术已成为病原微生物DNA指纹图谱分析的一项普通技术,是一种广泛应用的基因分型方法.
2.5 限制性片段多态性分析（restrietion fragmentlength polymorphi)
RFLP技术是指基因组DNA经限制性酶处理后,产生的片段直接通过琼脂糖电泳后,显现出不同的带型.利用BglⅡ和EcoRⅠ等酶消化细菌的基因组DNA,产生大量的短片段,再经过凝胶电泳得到细菌的DNA图谱,就可根据图谱分型.但由于DNA巨大,酶切后片段数量多,且重叠片段多,因此会造成菌株图谱一致性分析面临诸多麻烦[12]（Trindade PA,2003）.一般来说,RFLP 技术分辨力不高,且操作并不简单.
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参考文献：
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